PCR实验室操作流程

　乙型肝炎病毒（ HB Ｖ

　ＤＮA A

　ＰＣR R

　A A Ｂ I7300) ) 检侧标准操作程序

　一、ＩN N ＦO O ＲＭA A ＴI I ＯＮF F ＯT RTEST 检测信息

　项目名称 乙型肝炎病毒核酸 方法 聚合酶链反应 方法依据 卫生部《全国临床检验操作规程》第三版(2０06)第七篇第六章第一节 二、ＡＮＡ LYTICALPRINC ＴE PLE 检测原理

　聚台酶链式反应(ＰCR〕可对特定核苷酸片段进行指数级得扩增,而实时荧光定量 PCＲ技术,就是指在 PCＲ反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个ＰCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析得方法。在实时荧光定量 PCR 反应中,引入了一种荧光化学物质,荧光物质有两种:荧光探针与荧光染料。我们目前就是使用 TａqＭaｎ荧光探针得检测原理:ＰＣR 扩增时在加入一对引物得同时加入一个特异性得荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团与一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射得荧光信号被淬灭基团吸收；PＣＲ扩增时,Taq 酶得 5’一 3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团与淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条 DNA 链,就有一个荧光分子形成,荧光信号强度也等比例增加(图一)。这样就可以通过荧光强度变化监测产物量得变化,从而得到一条荧光扩增曲线图。

　三、操作步骤

　（一) ) 试剂配制

　1、进入试剂准备区，开启冰箱冷冻层取出 HBV-ＤNA 检测试剂盒。查瞧外包装盒(包括生产批号、有效期）,无误后拆开试剂盒,取出核酸提取液、反应液及 Taq 酶(核对核酸提取液、HBVPＣR 反应液及 Tａq

　酶管上批号与试剂外包装盒批号就是否一致)(图１）,不一致则不可使用,需更换新得试剂。室温平衡 2０min,完全融化后 2０0０rpm 离心备用。

　2、核酸提取液得分装 （１）取 0、５ｍl 离心管架置于超净工作台内(开机前用紫外线消毒30 分钟),用右手拿起镊子逐个将离心管放入离心管架（注意应夹住离心管外壁,不能碰到管内壁）,摆放顺序为横列从左往右摆，竖列为从上往下隔行排,离心管个数为 n(ｎ=样本数+对照品+质控品)。完成后将镊子放回原位(图 2)。

　(２）用移液器准确吸取核酸提取液 50uｌ分装至 0、5m1 离心管中(左上角第一排开始，从左住右依次加入)。因核酸提取液内含固体沉淀颗粒物,为使颗粒均匀分布,故每次取样时都要用移液器反复吸打3-4次（图 3)。分装完毕后将移液器量程归位。

　（3)加完一架后用右手拿镊子将离心管拿起,左手大拇指与中指夹紧离心管下部,然后用食指将盖子盖上，顺序为:从右下角第一个开始,从右住左依次盖上(图４),离心管盖全部盖完后，通过传递窗转移至标本处理区。

　3、HBV-DNA 反应液得配制 每批需设置空白对照、阴性对照、临界阳性对照(同时检测低值阳性质控品,则无需再检测临界阳性对照〕、阳性质控品、阳性标准品。所需每批需配制数 n=样本数+对照品+阳性标准品+质控品,每个测试反应体系配制如下表: 试剂 ＨBV PＣＲ反应液 Taｑ酶

　(1）每盒 HBV-DNＡ试剂可检测 32 人份,根据每日需检测标本份数计算出每批所需ＨBV ＰCR 反应液与Ｔaq 酶用量(例有 11１人份需要进行检测,则有 3 盒试剂可直接使用 10ul 移液器将 Taｑ酶加入 HＢV PCＲ反应液中,另有 1１1-３*3２=1５人份试剂需将 HBV PCＲ反应液与Ｔａq 酶使用移液器按反应体系比例吸取至 1、5m1 离心管中配制(图 5）。

　（2)取出离心后备用得HBV PCR反应液与Taq酶,按上述要求配制后用旋涡振荡器振荡混匀 5－１0sec,然后再用离心机 2000ｒｐm 离心10sec 备用(图 6)。

　(3)从操作台面上拿取 HBV－DHA 试剂配制盒(可选用空余得 200ｕ１枪头盒)至超净工作台内，打开配制盒并用记号笔在相应得孔位右旁按顺序编号（图 7）。编号规则为:样本扩增反应管对应得孔位按相应得样本流水号编写、阳性质控品反应管对应得孔位编“Q”(如有高值则标为 H,低值为Ｌ),阴性对照品孔位编“-”,临界阳性对照对应得孔位编“±”,空白对照对应得孔位编“B”,1 号标准品对应得孔位编“S１”,2 号标准品对应得孔位编“S2”,依此类推。

　(4）编号完毕后，用右手拿起镊子夹起反应管(ABI7300 使用得就是八联一薄壁反应管，镊子应夹住反应管外壁，不可接触到内壁。按(图8)所示方向依次将所有反应管(反应管数=ｎ)隔列摆放到配置盒上。

　(5）从离心机中取出已混好 Tａq 酶得ＰCR 反应液,用移液器(量程调至 36ul),准确吸取反应液并按从上到下、从左至右得顺序依次加至反应管中，注意:吸头应深入到反应管底部,放液时应缓慢,切勿形成气泡(图9)。全部加样完毕后将配制盒通过传递窗转移至样本处理区。

　用量(ul) 35、7 0、3

　 ( ( 二) ) 标本处理

　1、标本、质控品及对照品得处理 （1)从冰箱冷冻室取出 HＢV DNA 阳性质控品、阴性对照品,室温平衡 20min 待其完全融化。

　（２)核对标本与原始申请单得条形码与检验项目,无误后依次粘贴上相应得流水号,如 2、从传递窗中取出试剂准备区分装好核酸提取液得离心管架,移至生物安全柜内在管盖上用记号笔写上阿拉伯数字 1、2、3、、、、、、、,阳性质控管标上“Q”(如有高值则标为 H，低值为 L)，阴性对照管标上“-”，临界阳性对照管标上“±’，。离心管盖上标记得就是 1,就表示该管要加入流水号为 P0００1 得标本（图１0)。

　注意:每个离心管得编号方向都应朝向管口开启得方向。(图 1１）

　3、去除标本管盖:将标本从前处理取至标本准备区，按排列顺序依次去除样本管上得橡胶塞。具体操作为:在生物安全柜中,左手拿起血清管并固定,右手拇指与中指涅紧橡胶塞,右手食指轻轻顶住橡胶塞顶部凹面,逆时针方向轻轻旋下橡胶塞后废弃于装有消毒液得垃极桶(图１2)。(注意:手指切勿接触到血清管口或碰触到血清,如手套上有血清则需及时跟换新得手套;待所有样本管盖都去除完毕后,也需更换新得手套。) 4、样本及对照品得处理: a、左手拿起样本,用量程为２00u1 调至 50u1 得移液器准确吸取样本(注：为保证样本得均一性与吸样准确，每次取样时需用移液器将样本吸打 3-5 次；吸样时移液器套筒不可接触到样本管内壁）（图１3）

　ｂ、吸样完毕后,将样本管放至另一试管架中(切勿不可将样本放回原

　试管架位)(图１4)。

　c、再用左手按前面所述样本流水号与离心管编号得对应关系拿起相应得离心管,打开离心管盖(注:单手操作,食指与中指固定离心管,拇指稍向后上方发力打开管盖,手指切勿碰到离心管口与管盖内侧)(图１5)。

　d、管盖完全打开后,用左手食指、拇指与中指固定离心管,将吸头中得样本全部打入离心管底部,轻轻吸打混匀 3-５次。（图１6)

　e、加样完毕后弃枪头干盛有消毒液得垃极桶中（注：一个吸头只能用于一个样本得吸样,禁止使用一个吸头重复吸取不同样本）。同时盖上离心管盖并放回离心管架(放回得位置需另起一行,切不可放回原位)，继续处理下一个样本。对照品与质控品同病人样本一样处理。（图 17) f、待一架离心管全部加样完成后用振荡混匀器充分振荡混匀 10-１5秒。

　g、左手将混匀后得离心管转移至恒温金属浴上(注：离心管需对称得放置在恒温金属浴相匹配得孔槽内),用计时器计时,１00℃误差不超过±1℃〕干浴１０ｍin(误差不超过±30sec）。(图１８）

　干浴时用离心管架置于加热得离心管上,防止离心管盖因加热爆开导致标本间得污染(图１９)。

　h、十分钟后〔前后不超过半分钟),右手用摄子夹起橡皮垫从恒温金属浴中拿出离心管(图２０）。

　I、将上述离心管按顺序对称放入低温高速离心机转子孔内,摆放离心管时要将离心管开口朝内,盖上转子盖及离心机盖后，12，OOOrpm 离

　心１０min（注:离心时需在转子孔内放置 0、5m1 离心管专用适配器（图２１)。

　j、待离心结束后,取出离心管并按编号顺序依次摆放在离心管架上(参照(图１0）得排列方式)并 4"Ｃ冰箱保存备用;若当夭不使用,则应保存在一 20"Ｃ条件下,使用前置室温平衡 20min，再以 12,OOOｒｐm 离心 10ｍiｎ。

　5、待全部样本加样完毕更换手套，左手用镊子夹起反应管盖得一侧得延伸段(不要碰到管盖）,然后用右手大拇指从左住右依次盖紧管盖(不要碰到其她未盖得反应管口）（如图 22)。

　6、将反应管连同试剂配置盒通过传递窗传至扩增分析区。

　(三）扩增分析 1、打开扩增仪专用电脑,待电脑完全启动进入操作界面后再开启定量PCR 仪主机电源。

　a.按压托盘以打开它(图 23）。

　b、将反应管按顺序纵向放置放入反应板架(注:在反应管总数不足９6个时,应对称得将反应管放置在反应板架上，两边放置要求尽可能对称,可以防止热盖下压时发生倾斜，也可以使各反应管受力与受热都比较均匀）(图２4)。

　c、按压托盘以关闭它。